¹Universidad Estatal Península de Santa Elena UPSE - La Libertad - Ecuador, CP 240350

²Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL), Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Marinas (CENAIM) - Guayaquil – Ecuador - P.O. Box 09-01-5863

dfrodrig@espol.edu.ec

Título corto

Patogenicidad de Pseudomonas sp. en Penaeus vannamei

Resumen

Las Pseudomonas son organismos cosmopolitas y su impacto dentro de la acuicultura muestra distintas perspectivas. La cepa Pseudomonas sp. aislada de un sistema de producción larvaria de camarón Penaeus vannamei se evaluó en patogenicidad mediante inyección intramuscular y por inmersión en camarones de 3,93 ± 0,26 g. El resultado de la prueba patogénica mostró que la mortalidad promedio luego de 72 h post-infección (h.p.i), en los animales inyectados fue de 68,95 ± 1,77%, versus 64,44 ± 1,07% en los animales infectados por inmersión. La mortalidad del tratamiento control osciló entre 3-10%. La histología de hepatopáncreas evidenció una marcada respuesta inflamatoria, formación de granulomas, y necrosis de células hepatopancreáticas. La cepa de Pseudomonas evaluada demostró una alta capacidad patógena independientemente del método usado como vehículo de infección. Estos hallazgos denotan la necesidad de evaluar estrategias de control bacteriano en búsqueda de optimizar el rendimiento en sistemas de cultivo controlado.

Palabras clave: cultivo de camarón, inmersión, inyección intramuscular, patogenicidad, Penaeus vannamei

Abstract

Pseudomonas are cosmopolitan organisms, and their impact on aquaculture is diverse. The pathogenicity of a Pseudomonas sp. strain isolated from a Penaeus vannamei larval shrimp production system was evaluated by intramuscular injection and immersion in 3.93 ± 0.26 g shrimp. The results of the pathogenic test showed that the average mortality after 72 hours post-infection (h.p.i.) in the injected animals was 68.95 ± 1.77%, compared to 64.44 ± 1.07% in the animals infected by immersion. Mortality in the control treatment ranged from 3% to 10%. Hepatopancreas histology showed a marked inflammatory response, granuloma formation, and hepatopancreatic cell necrosis. The Pseudomonas strain tested demonstrated high pathogenicity regardless of the infection vehicle used. These findings highlight the need to evaluate bacterial control strategies to optimize performance in controlled culture systems.

Keywords: Penaeus vannamei, pathogenicity, shrimp culture, intramuscular injection, immersion

1. Introducción

Los camarones peneidos son los crustáceos de mayor producción acuícola a escala global, representando el 15% de los productos pesqueros comercializados internacionalmente [1]. En Ecuador la producción de camarón blanco Penaeus vannamei es la actividad acuícola más importante, alcanzando en el 2023 la cifra récord de 1 108 325 toneladas de producto vendido en distintos países de los cinco continentes, lo que generó ingresos por un total de USD 6 288M [2].

Este crecimiento en la industria de cultivo de camarones peneidos en América y Asia ha sido afectada por diversas enfermedades[3] [4], provocadas por algunos agentes etiológicos, como bacterias principalmente del género Vibrio [5] [6], fúngico [7][8], vírico [9] [10], y parasitario [11][12]. Indistintamente del origen etiológico, ocasionan grandes pérdidas económicas al sector [13]. Particularmente las enfermedades provocadas por bacterias se asocian a los Vibrios, entre los que se reportan: el Síndrome de la Gaviota [14], el síndrome de bolitas o síndrome de Zoea [15], la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) [16], entre otros. Las vibriosis, (enfermedades ocasionadas por bacterias del género Vibrio) son de importante consideración en el cultivo de camarón [17]. Bajo esta misma perspectiva el género Vibrio y algunas Pseudomonas son las causantes de varias afectaciones en el cultivo [18][19] Paradójicamente, los microorganismos, sean estas bacterias, Vibrio, y Pseudomonas, cumplen un importante rol en las piscinas de cultivo, particularmente en la productividad, ciclos de nutrientes, nutrición de los organismos cultivados, y en el impacto ambiental que tienen sobre los efluentes [20][21]. Por lo que en el medio de cultivo existe una interacción entre las especies patógenas y probióticas[22][23] complicando su manejo para una adecuada sinergia en el medio de cultivo. En el cultivo de camarón los microorganismos se distribuyen en el agua, sedimento y formando parte del microbiota intestinal[24].

Las Pseudomonas son microorganismos móviles, debido a la presencia de flagelos polares. Existen reportes de Pseudomonas sp. como patógenos en el cultivo de camarón[19]. No obstante, se ha señalado una visión variada acerca del efecto de las Pseudomonas sp. en el cultivo de camarón. Entre ellos, el efecto inhibitorio sobre la actividad patógena de Vibrios en P. vannamei [25], efecto probiótico [26], incluso de cepas de Pseudomonas aisladas del suelo de piscinas camaroneras [27] y el efecto benéfico de Pseudomonas aeruginosa en el cultivo de Penaeus monodon desafiados con Vibrios [28]. Por lo que estudios enfocados a dilucidar cual es el efecto directo de Pseudomonas (aisladas de cultivo de camarón) asociadas a mortalidades larvarias de camarón blanco son necesarios.

Las rutas de infección más utilizados son inmersión e inyección, y han sido ampliamente validados para determinar patogenicidad en camarones de cultivo. Estos métodos permiten reproducir la enfermedad bacteriana natural, que se produciría tras lesiones cuticulares, ecdisis o un desequilibrio en la flora bacteriana natural. Los objetivos de la presente investigación son (1) conocer el efecto de la exposición (inmersión e inyección) de Pseudomonas sp. sobre la salud del camarón Penaeus vannamei, y (2) mediante histología de la hepatopáncreas conocer la ruta que utiliza Pseudomonas sp. para afectar el camarón de cultivo, contrastando estas observaciones con histología de animales sanos (sin infectar).

2 Materiales y Métodos

2.1. Colecta de Muestras

Se colectaron muestras de agua (34 UPS), sedimento y post-larvas de dos tanques de cultivo de camarones (estadio post-larva VIII) de un laboratorio productor de post-larvas de camarón ubicado en Santa Elena, Ecuador (2°03′51,5”S, 80°44′10,7”O). Los tanques se eligieron por presentar coloraciones rosáceas en el fondo (presuntas colonias de Pseudomonas) [29]. Tres muestras aleatorias de agua (1 L) y sedimentos de cada tanque (Aprox. 10 g) de cultivo se recogieron de manera aséptica en botellas y bolsas de plástico estériles, respectivamente. Todas las muestras se transportaron inmediatamente al laboratorio de microbiología. Donde las muestras se utilizaron inmediatamente para el cultivo de bacterias y aislamiento de las Pseudomonas en agar específico (GSP agar, Merck).

2.2. Aislamiento e Identificación de Pseudomonas sp.

Para aislar la cepa de Pseudomonas, las muestras de agua, sedimento y de camarón P. vannamei se cultivaron y aislaron en medio de agar selectivo (GSP agar, Merck) utilizando el método de placa extendida [30]. Las placas de cultivo se incubaron a 32 °C durante 72 h. Se seleccionaron las colonias grandes con diámetro de 2-3 mm, color rojo-violeta, características típicas de las colonias del género Pseudomonas en el medio GSP agar [31][32]. Colonias individuales fueron transferidas a otras placas que contenían agar GSP usando la siembra por agotamiento, las placas se incubaron a las mismas condiciones antes mencionadas. Las colonias puras fueron crio-preservadas a –80°C, usando medio LB (Luria-Bertani) con 15 % de glicerol. Se realizó una confirmación de la producción de pigmento rojo-rosado por bacterias en el fondo de un contenedor de 50 L (Soltani et al. 2010). Para ello, se colocó una concentración de 2x106 UFC.mL en contenedor plástico de 50 L, con aeración leve. Después de la inoculación (24h) las bacterias aisladas produjeron un pigmento rojo-rosado en el fondo del contenedor.

2.3. Curva de Calibración

Para realizar ensayos microbiológicos bajo condiciones equivalentes es necesario trabajar con la misma cantidad de biomasa en una fase de crecimiento similar. Pseudomonas sp. se activó en placas Petri que contenían agar LB suplementado con cloruro de sodio al 2% (LBa-2% NaCl) e incubado a 30 °C durante 24 h. La cinética de crecimiento se determinó utilizando caldo LB suplementado con NaCl al 2% (LBc-2% NaCl). Brevemente, las colonias individuales se transfirieron a LBc-2% NaCl y se incubaron a 30 °C, 120 rpm durante la noche. Luego, el inóculo bacteriano se ajustó a una concentración de 1,5 × 108 UFC mL−1 utilizando un tubo McFarland estándar de 0,5. De este inóculo ajustado, se transfirió 1 mL a un matraz que contenía 999 mL de medio de cultivo LBc-2% NaCl fresco, por duplicado, y el matraz se incubó a 30 °C, 120 rpm durante 18 h. Cada 60 min, se extrajo una alícuota del cultivo y se utilizó para registrar la absorbancia y realizar la siembra por el método de placa extendida (Fig.1). La absorbancia se midió a (OD600 nm) utilizando un lector (Varioskan™ LUX, Thermo Scientific). Se dispensaron 200 µL de cultivo bacteriano, por triplicado, en placas de 96 pocillos. En paralelo, se realizaron diluciones seriadas de 10 veces y se sembraron 100 µL en la superficie de placas Petri que contenían LBa-2% NaCl, las placas se incubaron a 30 °C durante 18 h y se contaron las colonias bacterianas en placas que contenían menos de 400 colonias

2.4. Inóculo bacteriano

Pseudomonas sp. se activó en caldo LB-2% NaCl incubado a 30 °C con agitación constante (120 rpm) durante 12 h, un volumen del cultivo se transfirió a otro matraz que contenía LB-2% NaCl fresco y se dejó crecer durante 8 h a 30 °C y 150 rpm. El inóculo bacteriano se ajustó a 2 × 108 UFC mL-1 a una densidad óptica DO600 nm, y se realizaron cuatro diluciones seriadas (1/10) para obtener un inóculo ajustado de 1,5 × 104 hasta 1,5 × 108 UFC mL-1. Estos inóculos ajustados se utilizaron para la infección mediante inyección e inmersión.

2.5. Juveniles de Penaeus vannamei

500 camarones de 3,93 ± 0,26 g se transportaron desde una granja camaronera ubicada en Palmar, provincia de Santa Elena, Ecuador (2°02′16,7”S, 80°43′14,7”O) en un tanque de 1000 L, con salinidad 34 UPS y oxígeno disuelto entre 4-5 mg/L hacia un cuarto adecuado para el desafío en el interior de un laboratorio de producción de larvas de camarón en Monteverde, Santa Elena, Ecuador (2°03′51,5”S, 80°44′10,7”O). Para la aclimatación de los animales, se mantuvieron por 72 h en dos tanques de 1000 L (250 camarones por tanque) llenados previamente con agua de mar filtrada y esterilizada con UV a 34,0 UPS, temperatura ambiental (26,0°C) y proporcionando aeración moderada (3-5 mg/L O2).

Los camarones se alimentaron cada 24 horas con balanceado comercial (35% proteína), la dosis de alimento comercial utilizada fue del 3% del peso corporal promedio del camarón [33]. Se realizaron inter-diariamente rutinas de recambio de agua al 50% eliminando productos de excreción mediante sifón de las unidades experimentales. Cada recambio fue aprovechado para retirar la mortalidad y generar un registro.

2.6. Prueba de patogenicidad

La evaluación de la patogenicidad de los aislados de Pseudomonas> sp. se realizó mediante dos pruebas de desafío, usando la infección vía inyección y vía inmersión. Los camarones fueron aclimatados por 72 h antes de ser expuestas a la cepa de Pseudomonas sp. Los camarones se distribuyeron aleatoriamente en cajas plásticas rectangulares con volumen de agua de 40 L (30 camarones por unidad experimental, en 33 contenedores). Las unidades experimentales se llenaron previamente con agua de mar filtrada y esterilizada con UV a 34 UPS, temperatura ambiental (26.0°C) y proporcionando aeración moderada (3-5 mg/L O2).

Experimentación vía inyección: esta evaluación fue basada según recomendaciones de Wang et al. (2014) [34], la patogenicidad de Pseudomonas sp. se confirmó inyectando 100 µL del inóculo bacteriano a concentraciones finales 1,5 x 104; 1,5 x 105; 1,5 x 106; 1,5 x 107, y 1,5 x 108 UFC/mL a camarones juveniles P. vannamei por vía intramuscular (primer segmento abdominal) [35], como control se inyectaron 100 µL de solución salina estéril. La jeringa utilizada para este desafío fue la usada para inyección de insulina.

Prueba de desafío vía inmersión: consistió en adicionar el inóculo bacteriano a diferentes concentraciones finales 1,5 x 104= 0,07 mL; 1,5 x 105= 0,7 mL; 1,5 x 106= 7,0 mL; 1,5 x 107= 70,0 mL de Pseudomonas sp. directamente en el agua de la unidad experimental. Un tratamiento sin inóculo bacteriano fue incluido como tratamiento control. Los contenedores con camarones en ambos métodos de infección se mantuvieron sin recambio de agua, pero se retiró el excedente de alimento por medio de sifón cada 24 h. La alimentación se fijó en una dosis diaria mientras duró el desafío (72 horas).

2.7. Histopatología

De cada ruta de infección (inyección e inmersión), luego de 72 horas (fin del experimento) se tomaron seis camarones sanos y seis camarones moribundos (con sintomatología observable). Los camarones se colocaron en agua de mar filtrada y esterilizada con UV y se trasladaron al laboratorio para el análisis respectivo.

La salud de los camarones fue analizada por histopatología siguiendo el protocolo descrito por [36]. Brevemente, los camarones fueron fijados inyectando Davidson para preservar la estructura de los tejidos. Los tejidos fijados se deshidrataron en concentraciones ascendentes de alcohol, se aclararon en tolueno, se embebieron en parafina y se seccionaron con un micrótomo rotatorio a 5 μm. Posteriormente los tejidos seccionados se tiñeron con hematoxilina y eosina (H and E). Finalmente, se observaron en un microscopio óptico para identificar las alteraciones observables en la hepatopáncreas de los camarones desafiados.

2.8. Análisis estadístico

Para cumplir con las asunciones de homocedasticidad y homogeneidad de varianza se utilizaron las pruebas estadísticas de Shapiro Wilks y Barlett. Luego de ello, se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) para detectar las diferencias entre los tratamientos. Cuando se detectaron diferencias estadísticas significativas en la prueba ANOVA, se realizó la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Tukey para determinar diferencias significativas entre los tratamientos individuales a un nivel de significancia de p=0,05. Todos los datos se muestran como promedio con su desviación estándar (Sheskin, 2000).

Resultados

3.1. Identificacion Bacteriana

Se aisló cepa de Pseudomonas sp. en agar selectivo GSP agar a partir de muestras de agua, sedimentos y camarones recolectados en estanques de cultivo de camarones (Fig.2).Para identificar y discriminar el crecimiento de la Pseudomonas se siguieron recomendaciones de Kielwein [31][32]. Se observaron colonias grandes, con diámetro de 2-3 mm, y de una tonalidad azul violeta, rodeado por una zona roja-violeta (Tabla 1).

3.2. Pruebas de patogenicidad

Dentro de las primeras 24 h post-infección (h.p.i.) los signos clínicos observados en animales inyectados fueron anorexia, letargo, y ligero ablandamiento de la cutícula, ello, independientemente de la dosis inyectada, con una tasa de mortalidad de 13.33 a 20.00%. La patología de Pseudomonas sp., después de 48 h.p.i., evidenció una ligera coloración rosácea, junto con una musculatura opaca. Después de 72 h p.i., en los tratamientos 1,5 x 106, 1,5 x 107 y 1,5 x 108 UFC.mL fueron evidentes procesos necróticos de urópodos y telson, exoesqueleto y pereiopodos. La mortalidad más alta a las 48 h.p.i. del desafío se registró con la dosis 1,5 x 107, y 1,5 x 108 UFC.mL (33,33 ± 3,33%), incrementando ligeramente hasta 34,11 ± 5,09% a las 72 h.p.i. (Fig.3). Durante todo el ensayo camarones moribundos fondeados y mortalidades con sintomatología infecciosa fueron observados y retirados de los contenedores de evaluación.

Por otro lado, el tratamiento mediante inmersión también demostró una alta capacidad patógena de la cepa evaluada. La mortalidad osciló entre 12,22 y 17,78% en las primeras 24 h.p.i., incrementando hasta 25.55% a las 48 h.p.i. con las dosis más altas usadas por inmersión (1,5 x 105, 1,5 x 106, 1,5 x 107 UFC.mL). Finalmente a las 72 h.p.i la mortalidad aumentó hasta 27,78 ± 5,09 con la dosis 1,5 x 105 UFC.mL (Fig.4).

3.3. Histopatología

Mediante los cortes histológicos realizados a los camarones enfermos se observaron diversos grados de daño cuticular, infiltración hemocítica y cambios degenerativos en los tubulos del hepatopáncreas a las 72 h.p.i. (Fig.5A y 5B), además las estructuras poligonales del lúmen en el hepatopáncreas desaparecieron. Este análisis histológico mostró que los camarones usados como control mostraron hepatopáncreas con túbulos en condiciones normales (Fig. 5C).

4. Discusión

Las condiciones medioambientales de la costa continental ecuatoriana brindan escenarios ideales que los microorganismos oportunistas aprovechan para conseguir éxito en su desempeño. Además, las malas prácticas de manejo en los ciclos de producción, altas densidades de siembra, suministro elevado de alimento y uso de antibióticos producen un crecimiento de la actividad bacteriana [37]. Ello obliga a incluir dentro de los protocolos de producción, análisis microbiológicos que permitan conocer la dinámica bacteriana y con ello evitar desequilibrios en las piscinas de producción [38].

Los resultados del desafío mostraron que los camarones son susceptibles a la cepa de Pseudomonas sp. (aislada en esta investigación) en todas las concentraciones evaluadas. La cepa suministrada por inyección fue igual de virulenta que la suministrada por inmersión. La mortalidad promedio en los animales inyectados fue de 68,95± 1,77%, versus 64,44± 1,07% en los animales infectados por inmersión en 72 h.p.i., lo cual demuestra la alta capacidad patógena de la cepa usada.

Los métodos de infección usados, han sido ampliamente validados para determinar patogenicidad en camarones de cultivo [39][40][41][42][43][44]. Ello permite reproducir la enfermedad bacteriana natural, que se produciría tras lesiones cuticulares, ecdisis o un desequilibrio en la flora bacteriana natural [45]. El método de inmersión permite una libre colonización de las bacterias en el medio, por lo que la infección se produce al poco tiempo de interacción, ya sea por medio del contacto directo o por adherencia y penetración. Generalmente la colonización por bacterias parte en el aparato de alimentación del camarón, es decir, por la ingesta de alimentos contaminados o por ingesta de esporas [46]. A pesar de ello existen decápodos que tienen la capacidad de eliminar cantidades de bacterias inyectadas en su hemolinfa [47], específicamente en la hemolinfa de Sicyonia ingentis[48], Homarus americanus, y P[49]Penaeus monodon[50]. Esta eliminación bacteriana está asociada con una rápida y significativa disminución en el número de hemocitos circulantes [48]. Los hemocitos del camarón son las células inmunes vitales que participan en el sistema inmunológico innato como respuesta para defenderse contra patógenos [51]. En P. vannamei, se ha observado que la cantidad de hemocitos sufre una disminución cuando los camarones son desafiados con Vibrio harveyi[6]. En este sentido, algunos estudios han revelado respuestas diferenciales de los hemocitos del camarón y el proceso de diferenciación inmuno-funcional post-infección con WSSV [50]. En base a ello, es necesario conocer los mecanismos de defensa que desencadena en el camarón la infección con la cepa de Pseudomonas sp. aislada en esta investigación. Inmunológicamente, los microorganismos pueden ser eliminados directamente por fagocitosis, mientras que otros se limitan a nódulos o grupos de células [45]. En respuesta a la presencia de estos tejidos infectados, algunos hemocitos pueden migrar al tejido conectivo [47], los túbulos hepatopancreáticos y las branquias [49]. En el presente estudio se detectó la afectación en el hepatopáncreas, por lo que se sugiere dirigir esfuerzos para conocer el nivel de afectación en otros órganos del camarón e incluso en otros estadios más sensibles dentro de su ontogenie.

Los mecanismos de acción que utilizan las bacterias son variadas, algunas especies sintetizan una capa de exopolisacáridos que facilita la adhesión celular, la formación de biopelículas o biofilms, y la protege de la fagocitosis, de los anticuerpos, aumentando así su patogenicidad [45], causando degradación de los tejidos conectivos [51]. Las Pseudomonas poseen pigmentos que actúan como sideróforos (moléculas cuya función es capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo del microorganismo) [29]. Además, presentan una amplia capacidad para utilizar sustratos muy variados como fuente de carbono. Esta versatilidad se debe a la presencia de un gran número de plásmidos que contienen operones para la síntesis de enzimas específicas usadas para catabolizar los compuestos presentes en el medio, incluso en comparación con otros biofilms bacterianos, las biopelículas de Pseudomonas son más resistentes a los antibióticos [52]. Por ello, las Pseudomonas son capaces de colonizar un amplio rango de nichos [53].

Por el contrario, otros autores reportan el potencial de aplicar Pseudomonas en estanques de camarones para el tratamiento del agua [54]. Llegando incluso a identificar que las especies Pseudomonas stutzeri AM1 y Pseudomonas oleovorans ST1 (aislado de fondos de piscinas de producción de camarón) son potenciales probioticos para el cultivo de camarón [27][55], reporta igual situación para las especies Pseudomonas synxantha y Pseudomonas aeruginosa. Por otro lado, se ha demostrado que las Pseudomonas y bacterias filamentosas causan mortalidad en camarones [56]. Aunque se sabe poco sobre su capacidad para causar dicha mortalidad. Sobretodo de las Pseudomonas patógenas productoras de pigmento rojo-rosado que se desarrollan en los laboratorios de producción larvaria [29], cepa que ha demostrado ser altamente patógena para larvas y post-larvas tempranas de P. vannamei [29] evidenciando que Pseudomonas sp. aisladas de un cultivo larvario de camarón causan necrosis aguda e hidrólisis de las larvas y postlarvas. Estos daños en la cutícula pueden conducir a mortalidades como resultado de una muda fallida [57]. Es probable que la necrosis y la consecuente mortalidad que observamos en los camarones infectados tenga relación con la producción de toxinas extracelulares que generan las Pseudomonas, hipótesis ya planteada en investigaciones previas [29].

La hepatopáncreas en camarón (glándula digestiva) cumple funciones como la absorción de nutrientes, el almacenamiento de lípidos, desintoxicación y la producción de enzimas digestivas [58]. En nuestro estudio, se observó una marcada respuesta inflamatoria, formación de granulomas, y necrosis de células hepatopancreáticas, situación reportada también para M. rosenbergii infectado con P. aeruginosa [59]. Así mismo, la hepatopáncreas de los camarones infectados se mostró pobremente vacuolado, lo que indica bajas reservas de lípidos y glucógeno [60]. También registramos engrosamiento de las láminas basales de los túbulos invadidos. Investigaciones previas de desafío en P. vannamei con Pseudomonas fluorescence, los signos clínicos reportados fueron melanización en la superficie corporal y oscurecimiento de las puntas de los apéndices, inflamación de la cola, deformidad del rostro, oscurecimiento de las branquias y palidez de la hepatopáncreas [61] [62]. En hepatopancreas la histología reveló la presencia de filtración hemocítica, desprendimiento de células del hepatopáncreas, inflamación necrótica, tapón hemocítico, rotura de musculatura y edema epitelial [62]. Adicionalmente, camarones desafiados en nuestra investigación las estructuras poligonales del lumen en el hepatopáncreas desaparecieron.

La afectación patológica de Pseudomonas sp. fue letal en todos los tratamientos y no respondió de forma proporcional a la dosis, la duración, ni al método de infección. Esta capacidad altamente virulenta en el corto tiempo y la forma como afectan al organismo antes de provocar la muerte debe estudiarse más a fondo. Finalmente, a pesar que caracterizamos la bacteria de este estudio como Pseudomonas sp. es necesario dirigir esfuerzos para determinar la especie a la que pertenece, y evaluar posibles tratamientos que permitan controlar su afectación en cultivo de camarón.

Declaración ética

No se requirió ninguna declaración ética ni permisos especiales para esta investigación. Sin embargo, para garantizar el tratamiento ético de los animales, se utilizó un protocolo de anestesia-eutanasia de dos pasos de inmersión de los animales en alcohol al 60% y al 95% para sacrificarlos previo a su estudio histopatológico.

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo presentado en este artículo.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles previa solicitud razonable.

5. Referencias

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